噬菌體展示技術(shù)服務(wù)平臺(tái)

   M13單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是目前應(yīng)用廣泛的文庫(kù)展示系統(tǒng)，通過將蛋白、抗體或多肽與噬菌體pIII蛋白融合表達(dá)，使之參與噬菌體組裝，并展示在噬菌體表面，形成噬菌體展示文庫(kù)。使用噬菌體展示文庫(kù)，針對(duì)特定靶分子進(jìn)行3-5輪親和篩選，可以富集能特異性結(jié)合靶分子的噬菌體，得到相應(yīng)的 DNA序列信息。

　　艾柏森生物目前開發(fā)的噬菌體展示技術(shù)服務(wù)平臺(tái)涵蓋了免疫抗體庫(kù)、天然抗體庫(kù)等常用的文庫(kù)類型，可根據(jù)客戶的特殊需求定制個(gè)性化文庫(kù)，并提供靈活高效的篩選服務(wù)。

噬菌體展示服務(wù)簡(jiǎn)介

   M13單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是目前應(yīng)用廣泛的文庫(kù)展示系統(tǒng)，通過將蛋白、抗體或多肽與噬菌體pIII蛋白融合表達(dá)，使之參與噬菌體組裝，并展示在噬菌體表面，形成噬菌體展示文庫(kù)。使用噬菌體展示文庫(kù)，針對(duì)特定靶分子進(jìn)行3-5輪親和篩選，可以富集能特異性結(jié)合靶分子的噬菌體，得到相應(yīng)的 DNA序列信息。

　　艾柏森生物目前開發(fā)的噬菌體展示技術(shù)服務(wù)平臺(tái)涵蓋了免疫抗體庫(kù)、天然抗體庫(kù)等常用的文庫(kù)類型，可根據(jù)客戶的特殊需求定制個(gè)性化文庫(kù)，并提供靈活高效的篩選服務(wù)。

艾柏森生物平臺(tái)系統(tǒng)主要包括pComb3噬菌體展示系統(tǒng)和pCANTAB5e噬菌體展示系統(tǒng):

★  pComb3噬菌體展示技術(shù)流程

1>  抗體基因庫(kù)的獲得：收集目標(biāo)抗體宿主的免疫細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA；反轉(zhuǎn)錄后，使用多對(duì)引物分別擴(kuò)增VH-CH1抗體基因片段和VL-CL1抗體基因片段；

2>  抗體基因庫(kù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌：將以上擴(kuò)增的抗體基因庫(kù)連接至pComb3質(zhì)粒，隨后電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL12 Blue；同時(shí)鑒定基因庫(kù)庫(kù)容（及抗體基因的插入率）；

3>  噬菌體Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建：將輔助噬菌體VCSM13加入到轉(zhuǎn)入了抗體基因的，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌中進(jìn)行噬菌粒拯救；培養(yǎng)過夜后，離心收集上清即獲得噬菌體Fab抗體庫(kù)；

4>  抗體庫(kù)的滴度測(cè)定：取少量上述獲得的噬菌體Fab抗體庫(kù)，梯度稀釋后進(jìn)行噬斑培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察噬斑生長(zhǎng)情況以判斷噬菌體Fab抗體庫(kù)的滴度；

5>  噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選：使用靶標(biāo)抗原包被酶聯(lián)板，加入噬菌體抗體進(jìn)行孵育，隨后進(jìn)行洗板、洗脫；將洗脫下來的噬菌體抗體進(jìn)行中和后，再次感染細(xì)菌，并進(jìn)行第二輪的淘洗；共進(jìn)行3輪淘洗，每一輪洗脫后都進(jìn)行滴度測(cè)定；后一輪篩選時(shí)，設(shè)BSA包被的對(duì)照組以確定是否富集了大量抗BSA的噬菌體抗體。

圖1 pComb3噬菌體展示技術(shù)流程

圖2 噬菌粒載體pComb3遺傳圖譜

圖3 輔助噬菌體VCSM13遺傳圖譜

★  pCANTAB5e噬菌體展示技術(shù)流程

1>  ScFv基因庫(kù)的獲得：收集目標(biāo)抗體宿主的免疫細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA；反轉(zhuǎn)錄后，使用多對(duì)引物分別擴(kuò)增抗體基因VH和VL，純化回收VH和VL片段后，使用Linker引物將全套VH和VL基因隨機(jī)拼接成ScFv基因庫(kù)；

2>  ScFv基因庫(kù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌：將全套 ScFv 基因片段連接至pCANTAB5e載體，隨后電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1；同時(shí)鑒定ScFv基因庫(kù)庫(kù)容（及基因的插入率）；

3>  噬菌體ScFv抗體庫(kù)的構(gòu)建：將輔助噬菌體M13K07加入到轉(zhuǎn)入了ScFv抗體基因的，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌中進(jìn)行噬菌粒拯救；培養(yǎng)過夜后，離心收集上清即獲得噬菌體ScFv抗體庫(kù)；

4>  抗體庫(kù)的滴度測(cè)定：取少量上述獲得的噬菌體ScFv抗體庫(kù)，梯度稀釋后進(jìn)行噬斑培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察噬斑生長(zhǎng)情況以判斷噬菌體ScFv抗體庫(kù)的滴度；

5>  噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選：使用靶標(biāo)抗原包被酶聯(lián)板，加入噬菌體抗體進(jìn)行孵育，隨后進(jìn)行洗板、洗脫；將洗脫下來的噬菌體抗體進(jìn)行中和后，再次感染細(xì)菌，并進(jìn)行第二輪的淘洗；共進(jìn)行3輪淘洗，每一輪洗脫后都進(jìn)行滴度測(cè)定；后一輪篩選時(shí)，設(shè)BSA包被的對(duì)照組以確定是否富集了大量抗BSA的噬菌體抗體。

圖1 pCANTAB5e噬菌體展示技術(shù)流程

圖2 噬菌粒載體pCANTAB5e遺傳圖譜

圖3 輔助噬菌體M13K07遺傳圖譜

噬菌體展示技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目

表1 噬菌體展示技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目：噬菌體展示抗體庫(kù)構(gòu)建